LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 Biologinis aktyvumas

„In vitro“

Laukinio tipo ir G2019S transdukcija sukelia 2,5 karto didesnį TR-FRET signalą, kurį gali slopintiLRRK2-IN-1priklausomai nuo dozės, kai atitinkamai IC8 vertės yra 0,08 µM ir 0,03 µM [1]. LRRK2-IN-1 IC50 buvo 45 nM, kad slopintų DCLK2, ir jo IC50 yra didesnis nei 1 µM, įvertinus AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 ir PLK1 biocheminiuose tyrimuose. Patvirtinta, kad LRRK2-IN-1 slopina MAPK7, kai EC50 yra 160 nM. LRRK2-IN-1 sukelia nuo dozės priklausomą Ser910 ir Ser935 fosforilinimo slopinimą, kartu prarandamas 14-3-3 jungimasis tiek su laukinio tipo LRRK2, tiek su LRRK2 [G2019S], stabiliai transfekuotomis į HEK293 ląsteles [2]. LRRK2-IN-1 yra vidutiniškai citotoksiškas, kai IC50 yra 49,3 µM HepG2 ląstelėse. LRRK2-IN-1 rodo genotoksiškumą, jei yra S9, esant atitinkamai 15,6 ir 3,9 µM [3]. LRRK2-IN-1 slopina proliferaciją, migraciją ir sukelia ląstelių žūtį, naudodamas HCT116 ir AsPC-1 ląstelių apoptozės požymius [4] ..

In Vivo

LRRK2-IN-1 (100 mg / kg, ip) sukelia LRRK2 defosforilinimą pelių inkstuose [2]. Peritumoralinė LRRK2-IN-1 (100 mg / kg) injekcija lemia reikšmingą naviko tūrio ir svorio sumažėjimą AsPC-1 naviko ksenografuose [4].

Kinazės tyrimas

Aktyvus GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) ir GST-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527). ) fermentas išvalomas gliutationa sefaroze iš HEK293 ląstelių lizato 36 val. po atitinkamų cDNR konstruktų trumpalaikio transfekcijos. Peptidkinazės tyrimai, atlikti dviem egzemplioriais, pradedami iš viso 40 µL tūrio, kuriame yra 0,5 µg LRRK2 kinazės (kuri maždaug 10% grynumo suteikia galutinę 8 nM koncentraciją) 50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 0,1 mM. EGTA, 10 mM MgCl2, 20 µM niktido, 0,1 µM [γ-32P] ATP (500 cpm / pmol) ir nurodytos inhibitoriaus koncentracijos, ištirpintos DMSO. Po 15 minučių inkubacijos 30 ° C temperatūroje, reakcijos baigiamos užpylus 35 µL reakcijos mišinio ant P81 fosfoceliuliozės popieriaus ir panardinant į 50 mM fosforo rūgšties. Mėginiai plaunami plačiai, o [γ-32P] ATP įterpimas į Nictide yra nustatomas skaičiuojant Cerenkov. IC50 vertės apskaičiuojamos naudojant „GraphPad Prism“, naudojant netiesinę regresijos analizę.

Ląstelių tyrimas

Ląstelės (104 ląstelės kiekviename šulinyje) į trisdešimt egzempliorių pasėtos į 96 šulinėlių audinių kultūros plokštelę. Ląstelės kultivuojamos esant LRRK2-IN-1, naudojant DMSO kaip nešiklį esant 0, 0,31, 0,63, 1, 2 ir 5, 10 ir 20 μM. Po 48 val. Po apdorojimo į kiekvieną šulinėlį įpilama 10 μL TACS MTT reagento, ląstelės inkubuojamos 37 ° C temperatūroje, kol ląstelėse bus matomi tamsūs kristaliniai nuosėdos. Po to į šulinius įpilama 100 μL 266 mM NH4OH, esančio DMSO, ir 1 min. Dedama ant lėkštelės kratytuvo mažu greičiu. Po purtymo plokštelei leidžiama inkubuoti 10 minučių, apsaugotoje nuo šviesos, ir kiekvieno šulinio OD550 nuskaitomas naudojant mikroteklių skaitytuvą. Rezultatai sudedami ir apskaičiuojami kaip DMSO (transporto priemonės) valdymo priemonės + / - procentinės vertės vidurkis.

Gyvūnų administratorius

LRRK2-IN-1ištirpinamas „Captisol“ ir švirkščiamas į pilvaplėvės ertmę laukinio tipo patinams C57BL / 6 pelėms po 100 mg / kg dozę. Kontrolinėms pelėms sušvirkščiamas vienodas tūris Captisol. 1 ir 2 valandomis pelės sunaikinamos atlikus gimdos kaklelio išnirimą, o inkstų ir smegenų audiniai greitai išpjaustomi ir greitai užšaldomi skystame azote.

Nuorodos

[1]. Hermanson SB ir kt. Naujų LRRK2 inhibitorių atranka naudojant didelio pralaidumo „TR-FRET“ korinį tyrimą LRRK2 „Ser935 Phosphorylation.PLoS One“. 2012; 7 (8): e43580. 2012 m. Rugpjūčio 28 d.

[2]. Deng, Xianming., Et al. Parkinsono&# 39 ligos kinazės LRRK2 selektyvaus inhibitoriaus apibūdinimas. „Nature Chemical Biology“ (2011), 7 (4), 203–205.

[3]. Koshibu K ir kt. Alternatyva LRRK2-IN-1 Parkinsono&# 39 ligos farmakologiniams tyrimams. Farmakologija. 2015 m., 96 (5–6): 240–7.

[4]. Weygant N ir kt. Mažos molekulės kinazės inhibitorius LRRK2-IN-1 demonstruoja stiprų poveikį prieš gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžį, slopindamas dvigubamkortino tipo kinazę 1. Mol vėžys. 2014 m. Gegužės 6 d .; 13: 103