β-nikotinamido mononukleotido (NMN) gamyba Escherichia coli

Anotacija

Cukrinis diabetas yra lėtinė ir progresuojanti liga, kurios paplitimas nuolat auga, didėjantis finansinis spaudimas pasaulinėms sveikatos priežiūros sistemoms. Neseniai pelėms, gydomoms NAD ⁺ pirmtaku β-nikotinamido mononukleotidu (NMN) , buvo išgydytas atsparumas insulinui, kuris yra 2 tipo diabeto požymis. Toksinio poveikio nepastebėta. Tačiau NMN pasižymi aukšta kaina, reikia ekonomiškesnių gamybos būdų. Šis tyrimas siūlo biotechnologinį NMN gamybos būdą Escherichia coli . Parodome, kad bicistroninė rekombinantinės nikotinamido fosforiboziltransferazės (Nampt) ir fosforibozilpirofosfato (PRPP) sintetazės ekspresija esant nikotinamidui (NAM) ir laktozei gali būti sėkminga rentabilios NMN gamybos strategija. Baltymų ekspresijos vektoriai, turintys NAMPT geną iš Haemophilus ducreyi, ir PRPP sintetazė iš Bacillus amyloliquefaciens su L135I mutacija, buvo transformuoti Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Šiose ląstelėse, išaugintose PYA8 terpėje, papildytoje 0,1% NAM ir 1% laktozės, NMN produkcija pasiekė maksimalų 15,42 mg / l bakterijų kultūros (arba 17,26 mg / g baltymo gramo).

Įvadas

Tarptautinės diabeto federacijos duomenimis, 2017 m. Suaugusiųjų, sergančių 2 tipo cukriniu diabetu, skaičius buvo 425 milijonai, ir tikimasi, kad iki 2045 m. Jis pasieks 649 milijonus. Pasauliniu mastu išleidžiama 12% sveikatos priežiūros biudžeto (arba 727 milijardų JAV dolerių). dėl diabeto gydymo. Naujausi tyrimai susiejo atsparumą insulinui, kuris yra 2 tipo diabeto požymis, su mitochondrijų funkcijos sumažėjimu ir sumažėjusiu NAD ⁺ lygiu bei NAD ⁺ / NADH santykiu, stebėtu ir senstant. NAD ⁺ yra visuose gyvuose organizmuose ir yra gerai žinomas kofermentas oksidacijos-redukcijos reakcijose. Nuo NAD ⁺ priklausomi baltymų deacetilazės, tokie kaip SIRT1 ir SIRT6, veikia kaip metabolizmo jutikliai ir reguliuoja pasroviui nukreiptus kelius, kurie ilgainiui atstato mitochondrijų funkciją ir jautrumą insulinui. Ši išvada išplečia NAD ⁺ poveikio tyrimų sritį ir kitoms su senėjimu susijusioms degeneracinėms ligoms, tokioms kaip: širdies ir kraujagyslių sistemos, vėžys, artritas, osteoporozė ar Alzheimerio ligos.

Β-nikotinamido mononukleotidas (NMN) yra NAD ⁺ biosintezės tarpinis produktas, gaminamas iš nikotinamido (NAM) ir fosforibosilpirofosfato (PRPP) nikotinamido fosforibozil-transferazės fermento (Nampt) (EB 2.4.2.12). Būdamas gerai toleruojamas ir nepastebėtas šalutinių reiškinių, susijusių su ilgalaikiu pelių vartojimu, ir užkertantis kelią su amžiumi susijusiam fiziologiniam nuosmukiui, NMN pasirodė esąs veiksmingas gydant didelio riebalų kiekio dietos sukeltą 2 tipo diabetą, panaikinant mitochondrijų disfunkciją, susijusią su senėjimu, ir gelbėjant. su amžiumi susijusių nervinių kamieninių ląstelių nuosmukio poveikis.

NAM paprastai paverčiamas NMN fermentais, dalyvaujančiais NAD ⁺ gelbėjimo keliuose, tokiais kaip Nampt. Šio fermento veikimas sudaro pagrindinį NAD ⁺ anabolinį aktyvumą ląstelėje. Žinduolių ar mikroorganizmų nukleotidų apykaitos ir biosintezės reguliavimas paprastai vyksta suvartojant PRPP. PRPP susidaro iš ribozės-5-fosfato tiek per oksidacinį, tiek neoksidacinį pentozės fosfato kelią.

Bakterijose NAM dažniausiai virsta nikotino rūgštimi (NA) nikotinamidaze, kuri yra integruota Preiss-Handler kelyje, taip yra ir Escherichia col atveju . Nebuvo pranešta apie žinduolių nikotinamidazės aktyvumą; Vietoj to, NAM paverčiamas NMN vienu iš NAM fosforibozil-transferazės fermentų. Nors daugumoje bakterijų trūksta NAM fosforibosilo transferazės, fermentas ekspresuojamas Haemophilus ducreyi ir Shewanella oneidensis .

Biotechnologijose dažnai naudojami paprasti ir metaboliškai universalūs organizmai, tokie kaip Escherichia coli , kontroliuojamai baltymų, turinčių norimą fermentinį aktyvumą, ekspresijai. Tokius fermentus koduojanti DNR į bakterijas dažnai įvedama ekspresijos vektoriais, tokiais kaip pET sistema iš „Novagen“. PET vektoriai transformuojami bakterijose, ekspresuojančiose T7 RNR polimerazę, tokią kaip E. coli BL21 (DE3). Fermentų ekspresijos kontrolė pasiekiama naudojant lac promotorių, kuris ekspresiją įjungia tik esant laktozei (taip pat metabolizuojamai kaip anglies šaltiniui) arba jos sintetiniam struktūriniam analogui, izopropil-1-tio-β-D-galaktopiranozidui (IPTG) ( nemetabolizuojamas, esant pastoviai koncentracijai auginimo proceso metu). Kadangi bakterijų metabolizmas yra įvairus, anglies šaltinio kitimas ir terpėje papildytų fermentų substratų koncentracija yra pagrindiniai veiksniai, į kuriuos reikia atsižvelgti atliekant biotechnologinius procesus.

Siekdami išspręsti dabartinę didelę NMN kainų problemą, ankstesniame darbe mes pasiūlėme valymo metodą iš bakterijų ląstelių. Tolesniam proceso optimizavimui, kadangi mums pavyko rasti tik vieną paskelbtą mielių gamybos metodą, šiame tyrime siūlomas paprastas ir ekonomiškas NMN biotechnologinis gamybos būdas Escherichia coli .

Rezultatai

Bakterijų transformacija

Daugybinių aminorūgščių sekų derinimas, sukurtas tariamai NadV iš Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 ir Nampt iš Mus musculus , rodo didelį panašumą (pav. S1), todėl visi šie fermentai yra kandidatai į biotechnologinį procesą.

Transformuotas E. coli ląstelės su nadV (NAMPT) genais, gabenamos pET28a (+) plazmidėmis, sudarė kolonijas LB Agar plokštelėse, papildytose kanamicinu. Plokštelėse, kuriose buvo pasėjamos neransformuotos bakterijų ląstelės, kolonijų neaptikta. Iš šių kolonijų išskirtos plazmidės DNR agarozės gelio elektroforezė patvirtino Nampt-PET28a, pET28a-soNadV arba pET28a-hdNadV plazmidžių buvimą E. coli DH5α (papildomas S2A pav., 2, 3, 4 juosta). DNR juostos sutapo su juostomis iš E. coli BL21 (DE3) pLysS ląstelės (papildomas S2A pav., 6, 7, 8 juosta), kurios buvo transformuotos atitinkamomis plazmidėmis, išgautomis tiesiai iš E. coli DH5α. Neransformuotame E. coli BL21 (DE3) pLysS ląstelės, naudojamos kaip neigiama kontrolė, pLysS plazmidės buvimas buvo patvirtintas elektroforezės būdu, juosta, atitinkanti žinomą 4886 bp ilgį (papildomas S2A pav., 5 juosta), buvo parodyta agarozės gelyje.

(Norėdami gauti daugiau eksperimentinių duomenų, žiūrėkite originalią svetainę: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)